賽默飛3500系列遺傳分析儀器設(shè)置詳解

一、前言

Applied Biosystems 3500 和 3500xL 遺傳分析儀是賽默飛公司推出的基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的高性能DNA片段分析平臺。其廣泛應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、群體遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、微生物研究和個體識別等領(lǐng)域，以操作自動化程度高、結(jié)果重復(fù)性好、信號穩(wěn)定清晰著稱。

正確設(shè)置3500分析儀是確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行和獲得高質(zhì)量結(jié)果的基礎(chǔ)。儀器初裝調(diào)試、運(yùn)行參數(shù)設(shè)定、數(shù)據(jù)采集方法配置、光譜矩陣校準(zhǔn)、模板建立、運(yùn)行文件編制等每一個環(huán)節(jié)都需精準(zhǔn)操作。本文將圍繞設(shè)備結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)組件、參數(shù)配置、校準(zhǔn)方法、運(yùn)行模塊、分析模板、常見問題設(shè)定等方面，對賽默飛3500分析儀的完整設(shè)置流程進(jìn)行系統(tǒng)性闡述。

二、設(shè)備組成概覽

在設(shè)置前，用戶應(yīng)熟悉設(shè)備的核心硬件結(jié)構(gòu)及相關(guān)部件功能：

• 電泳模塊（Capillary Array）：8或24通道毛細(xì)管，負(fù)責(zé)DNA片段的電泳分離。

• 激光檢測系統(tǒng)：采用固態(tài)激光激發(fā)多色熒光染料。

• CCD探測器：接收熒光信號并轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像數(shù)據(jù)。

• 自動進(jìn)樣系統(tǒng)：控制樣本的吸取與注入。

• 聚合物泵送系統(tǒng)：將POP聚合物注入毛細(xì)管以維持電泳環(huán)境。

• 溫控系統(tǒng)：控制毛細(xì)管運(yùn)行環(huán)境溫度（一般為60℃）。

• 廢液系統(tǒng)：收集聚合物與電泳殘液。

• 用戶界面與運(yùn)行軟件：Data Collection、GeneMapper、SeqScanner等。

三、系統(tǒng)初始化與配置前準(zhǔn)備

1. 環(huán)境要求

• 溫度：20~25℃；

• 濕度：≤60%；

• 電源：220V/50Hz，具備UPS；

• 避免陽光直射、強(qiáng)磁干擾。

2. 設(shè)備檢查

• 檢查聚合物瓶、電泳緩沖液、廢液瓶是否安裝正確；

• 檢查毛細(xì)管陣列安裝是否到位；

• 樣本盤位置對準(zhǔn)，檢查自動進(jìn)樣托盤是否平穩(wěn)；

• 軟件系統(tǒng)連接狀態(tài)無誤，儀器主界面無報(bào)警標(biāo)志。

四、儀器設(shè)置流程總覽

賽默飛3500分析儀的完整設(shè)置主要包括以下幾個步驟：

1. 新建儀器模板與運(yùn)行模塊

2. 光譜校準(zhǔn)（Spectral Calibration）

3. 空間校準(zhǔn)（Spatial Calibration）

4. 儀器設(shè)置參數(shù)配置

5. 樣本文件與運(yùn)行文件創(chuàng)建

6. 分析方法模板（Analysis Method）配置

7. 數(shù)據(jù)路徑與項(xiàng)目管理設(shè)置

8. 質(zhì)量控制參數(shù)設(shè)定

五、儀器模板與運(yùn)行模塊配置

1. 運(yùn)行模塊（Run Module）設(shè)置內(nèi)容：

• 毛細(xì)管電壓：通常設(shè)置在13.5kV–15kV之間；

• 進(jìn)樣電壓/時間：例如1.2kV/15秒（依試劑盒說明書）；

• 運(yùn)行時間：按目標(biāo)片段大小選擇，如1200秒用于≤500bp片段；

• 溫度控制：默認(rèn)設(shè)定為60℃；

• 緩沖液類型：與試劑盒匹配，如使用Hi-Di Formamide；

• Dye Set選擇：如Dye Set J、G5、D等，匹配染料組合。

可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模⊿TR分析、測序、片段分析）設(shè)定不同的運(yùn)行模塊并命名保存。

六、光譜矩陣校準(zhǔn)（Spectral Calibration）

1. 校準(zhǔn)目的

分離不同熒光染料通道，避免信號重疊，確保每種染料信號被正確識別。

2. 校準(zhǔn)流程

• 使用Spectral Calibration標(biāo)準(zhǔn)品（如 DS-33 或 DS-30）；

• 設(shè)置染料類型與使用通道；

• 運(yùn)行光譜采集程序；

• 軟件自動計(jì)算色譜矩陣；

• 保存并應(yīng)用校準(zhǔn)結(jié)果。

建議每兩個月或更換毛細(xì)管、電泳緩沖液、染料種類后重新校準(zhǔn)。

七、空間校準(zhǔn)（Spatial Calibration）

1. 校準(zhǔn)目的

確保多通道毛細(xì)管在CCD上對應(yīng)的檢測位置一致，避免峰錯位。

2. 操作流程

• 插入空間校準(zhǔn)板；

• 運(yùn)行空間校準(zhǔn)模塊；

• 檢查圖像文件是否穩(wěn)定、對稱；

• 若失敗，檢查進(jìn)樣臂移動軌跡和通道潔凈度。

建議每季度進(jìn)行一次，或在更換毛細(xì)管后執(zhí)行。

八、分析方法與模板建立

1. Analysis Method設(shè)置

• Basecaller：用于Sanger測序；

• Sizing Method：用于片段大小計(jì)算；

• Peak Detection：設(shè)置最低峰值強(qiáng)度閾值；

• Baseline Window：定義基線范圍，如51點(diǎn)移動平均；

• Size Standard設(shè)置：如LIZ500、LIZ600等；

• Ladder or Standard Migration Correction：執(zhí)行遷移率修正。

2. 數(shù)據(jù)路徑配置

• 設(shè)置樣本數(shù)據(jù)的存儲目錄；

• 每個項(xiàng)目建立獨(dú)立文件夾便于數(shù)據(jù)管理；

• 可啟用自動命名規(guī)則提高追蹤性。

九、樣本文件與運(yùn)行文件創(chuàng)建

1. Sample Sheet文件

包含以下字段：

• 樣本編號；

• 樣本位置信息（A01–H12）；

• 分析方法模板名稱；

• 使用染料類型與Size Standard名稱；

• Project名稱與數(shù)據(jù)保存路徑。

2. Plate文件創(chuàng)建

• 指定樣本文件所用樣本板類型（96孔或384孔）；

• 與樣本工作表對應(yīng)；

• 選擇運(yùn)行模塊；

• 命名該次運(yùn)行并保存。

創(chuàng)建完成后在儀器主界面選擇該運(yùn)行任務(wù)，確認(rèn)無誤后啟動分析。

十、質(zhì)量控制參數(shù)設(shè)置

1. Signal Intensity設(shè)置

• 建議將最小峰高設(shè)置為100–150 RFU；

• 峰寬限制在7–20數(shù)據(jù)點(diǎn)之間；

• 建議開啟“Pull-Up”檢測以排除染料串?dāng)_。

2. 重復(fù)樣本驗(yàn)證

• 每次分析包含一個重復(fù)樣本；

• 檢查峰值遷移位置是否一致；

• 若出現(xiàn)≥0.3 bp偏差，可能存在溫控異?；蛎?xì)管堵塞。

十一、常見設(shè)置錯誤與處理建議

十二、儀器設(shè)置維護(hù)與更新建議

• 每季度進(jìn)行一次全系統(tǒng)校準(zhǔn)；

• 使用原廠耗材以確保兼容性；

• 每次軟件升級后重新驗(yàn)證運(yùn)行模塊有效性；

• 建議使用統(tǒng)一命名規(guī)范進(jìn)行方法模板管理；

• 設(shè)置管理員與操作員不同權(quán)限，防止參數(shù)誤改；

• 定期備份系統(tǒng)設(shè)置文件和分析方法模板。

十三、結(jié)語

賽默飛3500系列遺傳分析儀在分子生物學(xué)與法醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著不可替代的作用。其分析結(jié)果的可靠性、片段分型的準(zhǔn)確性以及高通量處理能力，都建立在科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膬x器設(shè)置基礎(chǔ)之上。通過規(guī)范化儀器設(shè)置流程、精細(xì)化參數(shù)配置、持續(xù)性運(yùn)行校準(zhǔn)、智能化軟件管理，可以大幅提升實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量、減少運(yùn)行故障、降低返工風(fēng)險(xiǎn)。

儀器設(shè)置不僅是技術(shù)工作的起點(diǎn)，更是質(zhì)量控制體系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。建議實(shí)驗(yàn)室依據(jù)自身項(xiàng)目需求，制定定期校驗(yàn)制度與設(shè)置模板庫，實(shí)現(xiàn)全流程標(biāo)準(zhǔn)化與實(shí)驗(yàn)操作一致性，從而打造一個高效、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。