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質保3年只換不修，廠家長沙實了個驗儀器制造有限公司

一、設備與樣品概述

伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2660是一款高精度的電轉化系統(tǒng)，廣泛應用于分子生物學、基因工程、細胞轉染和基因編輯實驗。該設備通過瞬時高壓脈沖在細胞膜上形成可逆性微孔，使外源DNA、RNA或蛋白質進入細胞內部。
在整個實驗體系中，樣品的質量與處理方式是影響電穿孔效果的核心要素之一。即使儀器性能再優(yōu)異，若樣品不符合電轉化要求，也會導致低轉化效率或細胞死亡率升高。因此，在正式操作前，樣品的準備與質量控制至關重要。

伯樂165-2660的設計允許在廣泛的樣品類型下使用，包括細菌、酵母、植物原生質體、哺乳動物細胞、干細胞以及原代組織細胞。不同類型樣品的物理特性、導電性及生理狀態(tài)差異較大，需依據各自特征制定相應的預處理方案。

二、樣品的基本要求

1. 細胞活性要求

電穿孔實驗要求細胞處于高活性、對數生長期或生理穩(wěn)定狀態(tài)。

• 對于細菌和酵母，需確保處于指數生長期，OD600值一般在0.5–0.8之間；

• 對于真核細胞，應選擇處于生長旺盛、貼壁良好、形態(tài)均一的群體；

• 原代細胞或干細胞實驗需避免細胞過度分化或凋亡。

細胞活性直接影響膜恢復能力與電穿孔后復蘇效率。若樣品活性下降，將導致電場作用下膜損傷不可逆，實驗失敗率增加。

2. 樣品純度要求

電穿孔過程中電流需通過樣品液體形成穩(wěn)定電場，因此樣品純度必須高。
污染的離子、蛋白、雜質會改變導電性并導致電弧放電。

• 所有細胞懸液應使用無離子緩沖液洗滌2–3次；

• DNA、RNA樣品需純度高、無蛋白或有機溶劑殘留；

• 若使用商業(yè)提取試劑，應在最后步驟徹底去除鹽分。

純度不足的樣品容易產生“電弧效應”，不僅損壞電極，也使細胞全部死亡。

3. 樣品濃度要求

適當的細胞濃度有助于形成均勻的電場環(huán)境。濃度過高會造成電阻降低、放電不均；濃度過低則導致轉化效率不足。
一般推薦濃度如下：

DNA或RNA加入量通?？刂圃跇悠敷w積的1–10%范圍內，濃度建議為10–100 ng/μL。過高濃度會導致黏度增加、局部電場分布不均。

三、緩沖液及離子環(huán)境要求

1. 緩沖液導電性

電穿孔要求液體導電性低，以防止能量被離子消耗或引發(fā)電弧。伯樂建議使用專用的無離子電穿孔緩沖液。常用溶液包括：

• 無鹽HEPES緩沖液；

• 無離子甘露醇緩沖液；

• 低離子含量PBS衍生液（需特別去除NaCl）。

導電性理想值應低于 5 μS/cm。若使用水或普通生理鹽水，極易導致高電流和熱損傷。

2. pH與滲透壓

電穿孔過程中，細胞膜短暫暴露在高電場下，若溶液pH或滲透壓異常，會加劇細胞應激。

• pH應維持在7.0–7.4范圍；

• 滲透壓需接近細胞內環(huán)境，尤其是原生質體與動物細胞，應添加等滲組分（如250 mM蔗糖或甘露醇）。

高滲或低滲環(huán)境均可能導致細胞形態(tài)異常，降低膜修復能力。

3. 緩沖液溫度

低溫有助于減少電穿孔過程中熱效應。實驗前所有緩沖液應預冷至 4°C 左右，但不得凍結。溫度過低會增加液體電阻，而溫度過高會導致膜不可逆破裂。

四、DNA與RNA樣品要求

1. 純度與濃度

核酸樣品應具備較高純度，A260/A280比值在1.8–2.0之間。任何鹽離子、乙醇、酚或蛋白殘留都會干擾放電波形。
若使用乙醇沉淀純化的DNA，需徹底干燥殘留乙醇后再溶于無鹽緩沖液中。

濃度建議：

• 質粒DNA：10–100 ng/μL；

• 線性DNA：20–200 ng/μL；

• mRNA：0.1–1 μg/μL。

2. 分子大小

質粒或線性DNA分子越大，進入細胞所需電場強度越高。一般情況下，小質粒（<10 kb）電壓1.5–2.0 kV即可，而大分子載體可能需略高電壓或延長脈沖時間。
對于RNA類樣品，應避免長時間暴露空氣，實驗全程保持無RNA酶環(huán)境。

3. 緩沖體系相容性

DNA或RNA應溶解于與細胞懸液成分相容的緩沖體系中，避免離子濃度差異導致局部電壓集中。常用溶劑包括無鹽Tris、TE（低離子型）或超純水。

五、不同樣品類型的具體要求

1. 細菌樣品

• 應選用新鮮培養(yǎng)、無污染的菌株；

• 在冰浴條件下洗滌，使用低導電性溶液（10%甘油或無鹽Tris）；

• 質粒加入量控制在樣品體積的1–2%；

• 電轉杯需充分預冷，避免局部過熱。

若出現(xiàn)放電火花，說明樣品鹽分過高，應重新洗滌。

2. 酵母與真菌樣品

酵母細胞壁較厚，需提前酶解或化學預處理以增強膜通透性。常用方法包括β-葡聚糖酶處理或短暫高溫沖擊。
電穿孔時建議使用含蔗糖或山梨醇的滲透緩沖液，保證細胞不因滲透壓差破裂。
樣品溫度應保持在0–4°C，減少熱應激。

3. 哺乳動物細胞

哺乳動物細胞對電場極為敏感，要求：

• 懸浮狀態(tài)均一，無團聚；

• 緩沖液無鈣鎂離子，導電性低；

• 樣品體積一般為50–100 μL；

• DNA質量高，避免載體內內毒素殘留。

放電結束后，應立即轉入含血清培養(yǎng)基中復蘇，以促進膜修復。

4. 植物原生質體

植物原生質體需通過酶解法制備，確保細胞壁完全去除。

• 懸浮介質含0.5 M甘露醇或蔗糖，維持等滲；

• 電轉樣品應避免氣泡形成；

• 電壓0.6–1.0 kV，電容1000 μF，放電時間10 ms左右；

• 放電后立即在低溫等滲液中靜置數小時以恢復膜完整性。

5. 干細胞與免疫細胞

此類細胞結構脆弱，應嚴格控制電壓與時間常數。
樣品需新鮮分離，避免離心過度；
緩沖液可使用專用電穿孔緩沖體系，維持滲透壓與細胞活性。
RNA或RNP導入實驗中應全程無RNA酶操作，并在冰上快速進行。

六、樣品體積與電轉杯要求

1. 體積控制

電轉杯體積決定電場分布。伯樂165-2660兼容多種電轉杯規(guī)格，常用為0.1 cm、0.2 cm和0.4 cm間隙。

液體體積過多易產生電流不均，過少則易形成氣泡導致電弧。液面應平整且無氣泡，操作時可輕輕敲擊杯壁排氣。

2. 電極清潔與杯體狀態(tài)

電極若附著鹽分或蛋白，會增加局部電阻，產生放電異常。實驗前應使用無離子水或70%乙醇清洗杯體，并自然晾干。
杯體表面需保持完好、無劃痕，以防電流集中造成電弧。

七、樣品溫度與環(huán)境控制

溫度直接影響液體電阻與細胞膜穩(wěn)定性。

• 推薦操作溫度為0–4°C；

• 樣品應全程置于冰上，但不得凍結；

• 高溫會加快膜破裂并降低存活率。

實驗結束后，應立即將樣品移入預溫培養(yǎng)基中復蘇，避免因溫差導致細胞應激。

八、實驗前準備與檢測

1. 樣品檢測：
   在正式電穿孔前，可取少量樣品檢測電導率，理想值為4–6 μS/cm。若過高，應繼續(xù)洗滌。

2. 氣泡檢查：
   樣品裝入電轉杯后，仔細觀察是否有氣泡。氣泡是導致放電失敗的主要原因之一。

3. 濃度確認：
   若細胞過于密集，可適度稀釋。對于高密度樣品，需避免形成聚團。

4. 質粒測試：
   在大規(guī)模轉化前，應以小樣測試質粒質量與濃度，確定最優(yōu)條件。

九、樣品穩(wěn)定性與存儲

實驗用樣品應現(xiàn)制現(xiàn)用，不建議長時間儲存。若確需保存：

• 細胞懸液可在4°C短期存放，不超過2小時；

• DNA、RNA樣品可置于-20°C長期保存，但使用前需緩慢解凍并保持無菌環(huán)境；

• 電轉杯不得重復使用污染樣品，避免交叉反應。

十、常見問題與解決方案

十一、樣品優(yōu)化策略

伯樂165-2660具備高精度電壓與電容控制系統(tǒng)，允許實驗者針對不同樣品進行細致優(yōu)化。優(yōu)化過程可分為以下步驟：

1. 從較低電壓開始逐步提高，觀察時間常數變化；

2. 調整細胞濃度與DNA比例；

3. 記錄每次實驗的溫度、時間常數與復蘇結果；

4. 通過統(tǒng)計分析確定最優(yōu)條件。

建立樣品數據庫后，后續(xù)實驗可快速調用參數，提高效率與重復性。