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質(zhì)保3年只換不修，廠家長(zhǎng)沙實(shí)了個(gè)驗(yàn)儀器制造有限公司

一、概述

伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2661是一款專業(yè)的高壓脈沖電轉(zhuǎn)化儀，專為基因?qū)?、?xì)胞電轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)而設(shè)計(jì)。該設(shè)備通過瞬時(shí)高壓脈沖在細(xì)胞膜上形成可逆性孔洞，使外源DNA、RNA或其他帶電分子穿過細(xì)胞膜，從而實(shí)現(xiàn)高效導(dǎo)入。

165-2661作為伯樂電穿孔儀系列的改進(jìn)型號(hào)，在電壓精度、能量釋放速度、放電穩(wěn)定性以及電弧防護(hù)系統(tǒng)方面均有顯著提升。其操作系統(tǒng)采用數(shù)字化控制面板，可自動(dòng)計(jì)算時(shí)間常數(shù)（τ），并具備多組參數(shù)存儲(chǔ)功能，便于用戶快速調(diào)用常用實(shí)驗(yàn)設(shè)置。

本文將對(duì)165-2661的操作步驟、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、放電執(zhí)行流程、安全管理及數(shù)據(jù)記錄方法進(jìn)行系統(tǒng)闡述，以指導(dǎo)科研人員在操作中實(shí)現(xiàn)高重復(fù)性、高效率與安全性的統(tǒng)一。

二、操作前準(zhǔn)備

1. 環(huán)境要求

• 實(shí)驗(yàn)室溫度：20–25°C；

• 相對(duì)濕度：≤60%；

• 電源規(guī)格：AC 220 V ±10%，50/60 Hz；

• 接地電阻：≤1 Ω；

• 環(huán)境條件：無強(qiáng)磁場(chǎng)干擾、無高濕、無導(dǎo)電塵埃；

• 通風(fēng)要求：儀器背部至少保持30 cm的散熱間距。

2. 儀器檢查

在開機(jī)前必須完成以下自檢：

1. 檢查電源線是否完好并確認(rèn)接地端連接正確；

2. 檢查電極接口、輸出端無污漬與腐蝕；

3. 確認(rèn)安全蓋感應(yīng)系統(tǒng)靈敏；

4. 清潔電轉(zhuǎn)杯與支架，避免殘留鹽分或水分；

5. 檢查主機(jī)顯示屏能正常亮起，鍵盤操作響應(yīng)靈敏。

如設(shè)備自檢失敗或出現(xiàn)“Check System”提示，應(yīng)停止使用并聯(lián)系維護(hù)人員。

三、樣品準(zhǔn)備步驟

1. 細(xì)胞制備

根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象不同，細(xì)胞制備方式略有差異。以下以常見的大腸桿菌和哺乳細(xì)胞為例：

• 細(xì)菌（如E. coli DH5α）

1. 取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220 rpm培養(yǎng)過夜；

2. 將1 mL菌液接種入100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD???≈0.4；

3. 離心收集菌體（4000 rpm，4°C，5分鐘）；

4. 使用冰冷10%甘油溶液洗滌3次，去除培養(yǎng)基鹽分；

5. 重懸于10%甘油溶液中，濃度約1×10? cells/mL；

6. 4°C保存，24小時(shí)內(nèi)使用。

• 哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如CHO或HeLa）

1. 使用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，收集并離心；

2. 重懸于無血清緩沖液或電穿孔專用緩沖液中；

3. 調(diào)整濃度至2×10? cells/mL；

4. 保持低溫備用（4°C）。

2. 樣品混合

1. 將外源DNA或RNA溶液（通常為1–2 μg）加入感受態(tài)細(xì)胞中；

2. 混合均勻后置于冰上預(yù)冷3–5分鐘；

3. 檢查液體是否無氣泡，避免放電時(shí)產(chǎn)生電弧。

3. 電轉(zhuǎn)杯準(zhǔn)備

• 選擇合適間隙的電轉(zhuǎn)杯（0.1、0.2或0.4 cm）；

• 使用無菌純水清洗并風(fēng)干；

• 放入冰上預(yù)冷10分鐘后使用。

四、參數(shù)設(shè)定步驟

165-2661的數(shù)字化面板可實(shí)現(xiàn)高精度參數(shù)設(shè)定。以下為詳細(xì)設(shè)置流程：

1. 電壓設(shè)定（Voltage）

• 按下“VOLTAGE”鍵進(jìn)入電壓設(shè)定界面；

• 使用方向鍵輸入所需電壓（范圍0.2–2.5 kV）；

• 按“ENTER”確認(rèn)。

2. 電容設(shè)定（Capacitance）

• 按“CAP”鍵選擇電容檔位；

• 可調(diào)范圍：25、50、125、250、500、1000、3300 μF；

• 系統(tǒng)自動(dòng)切換儲(chǔ)能單元并顯示實(shí)際值。

3. 電阻選擇（Resistance）

• 默認(rèn)固定電阻200 Ω；

• 特殊實(shí)驗(yàn)可啟用外接電阻模塊（選配）。

4. 模式選擇（Mode）

• 單脈沖模式：適合細(xì)菌、酵母等；

• 多脈沖模式：適合哺乳動(dòng)物細(xì)胞；

• 程序模式：保存常用參數(shù)，快速調(diào)用。

5. 安全檢測(cè)確認(rèn)

• 設(shè)備自動(dòng)檢測(cè)電極接觸、電源接地及安全蓋狀態(tài)；

• 顯示“Ready to Pulse”后方可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

五、電穿孔操作步驟

1. 樣品裝載

1. 吸取40–50 μL細(xì)胞混合液加入電轉(zhuǎn)杯；

2. 確保液面均勻覆蓋電極表面；

3. 輕拍電轉(zhuǎn)杯底部，排出微小氣泡；

4. 插入電擊槽，確保電極完全接觸。

2. 啟動(dòng)放電

1. 關(guān)閉安全蓋；

2. 按下“PULSE”鍵；

3. 系統(tǒng)瞬時(shí)釋放儲(chǔ)能電量并開始放電；

4. 顯示屏實(shí)時(shí)顯示放電電壓、時(shí)間常數(shù)（τ）及狀態(tài)信息；

5. 放電完成后屏幕顯示“Pulse Complete”。

3. 放電時(shí)間與狀態(tài)判斷

• 正常放電：顯示“OK”，時(shí)間常數(shù)為穩(wěn)定衰減曲線（如4.8 ms）；

• 電弧放電：顯示“ARC DETECTED”，表示樣品導(dǎo)電性過高或存在氣泡；

• 放電中斷：顯示“ABORTED”，通常由安全蓋打開或接地異常引起。

如檢測(cè)到異常，應(yīng)立即停止操作，重新制備樣品或檢查電轉(zhuǎn)杯。

六、放電后的處理步驟

1. 樣品冷卻
   放電后立即取出電轉(zhuǎn)杯并置于冰上1–2分鐘，防止熱效應(yīng)損傷細(xì)胞。

2. 復(fù)蘇與培養(yǎng)

• 向電轉(zhuǎn)杯中加入1 mL冰冷SOC或無血清培養(yǎng)基；

• 輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至離心管；

• 在37°C下復(fù)蘇60分鐘（細(xì)菌）或在37°C、5% CO?條件下復(fù)蘇4小時(shí)（哺乳細(xì)胞）。

3. 篩選培養(yǎng)

• 涂布含抗生素的平板（對(duì)細(xì)菌）；

• 接種入選擇性培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)染培養(yǎng)體系（對(duì)真核細(xì)胞）；

• 培養(yǎng)12–24小時(shí)后觀察結(jié)果。

七、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄

伯樂165-2661具備數(shù)據(jù)存儲(chǔ)與導(dǎo)出功能。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)記錄以下信息：

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可通過USB接口導(dǎo)出至電腦進(jìn)行存檔與分析。

八、安全注意事項(xiàng)

1. 高壓防護(hù)

• 嚴(yán)禁在安全蓋打開時(shí)放電；

• 操作時(shí)手部不得接觸電極區(qū)域；

• 每次放電后等待5秒再取樣，防止殘余電荷。

2. 樣品安全

• 使用低導(dǎo)電緩沖液，避免電弧損壞；

• 禁止含鹽PBS或NaCl溶液進(jìn)入電轉(zhuǎn)杯；

• 每次實(shí)驗(yàn)后清洗電極，防止鹽沉積。

3. 環(huán)境防護(hù)

• 保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)干燥，防止漏電；

• 遠(yuǎn)離磁性設(shè)備與熱源；

• 放電時(shí)避免他人靠近。

4. 異常處理
   若設(shè)備報(bào)警或屏幕閃爍異常，應(yīng)立即斷電；
   檢查高壓電纜連接與接地狀態(tài)，確認(rèn)無異常后再重新啟動(dòng)。

九、操作流程標(biāo)準(zhǔn)化建議

為確保重復(fù)性與安全性，建議建立以下標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）：

1. 開機(jī)前檢查表

• 電源與接地是否正常；

• 電極與電轉(zhuǎn)杯是否干凈；

• 溫度與濕度是否達(dá)標(biāo)。

2. 參數(shù)記錄模板
   每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)完整記錄電壓、電容、時(shí)間常數(shù)、溫度及電弧狀態(tài)。

3. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
   同一條件下連續(xù)放電10次，若時(shí)間常數(shù)標(biāo)準(zhǔn)偏差<0.2 ms，則系統(tǒng)穩(wěn)定。

4. 月度維護(hù)

• 清潔電極接口；

• 檢查風(fēng)扇與散熱系統(tǒng)；

• 驗(yàn)證電壓輸出精度（偏差≤1%）。

十、常見問題與解決措施

十一、實(shí)驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化建議

1. 優(yōu)化電壓與電容比例
   電壓決定電場(chǎng)強(qiáng)度，電容影響能量持續(xù)時(shí)間。
   細(xì)菌推薦2.5 kV/25 μF；哺乳細(xì)胞推薦0.4–0.8 kV/250 μF。

2. 控制時(shí)間常數(shù)
   理想時(shí)間常數(shù)應(yīng)保持在4–10 ms之間。
   過短導(dǎo)致導(dǎo)入不完全，過長(zhǎng)增加熱損傷。

3. 緩沖液優(yōu)化
   使用電導(dǎo)率≤10 μS/cm的低離子緩沖體系；
   推薦使用10%甘油、HEPES或Tris衍生緩沖液。

4. 樣品體積與間隙匹配
   確保液體完全覆蓋電極表面；
   間隙過大或體積不足均會(huì)影響電場(chǎng)均勻性。

十二、實(shí)驗(yàn)實(shí)例

以大腸桿菌DH5α為模型的電穿孔實(shí)例：

• 電壓：2.5 kV

• 電容：25 μF

• 電轉(zhuǎn)杯間隙：0.2 cm

• 樣品體積：50 μL

• 時(shí)間常數(shù)：4.8 ms

• 結(jié)果：獲得穩(wěn)定菌落，轉(zhuǎn)化效率9.6×10? CFU/μg DNA。

此條件下能量釋放平穩(wěn)，細(xì)胞活性高，證明儀器性能可靠。